Effect of plasma separation techniques and sperm selection on sperm recovery and viability of cooled pony stallion semen for 48h at 5°C / [Efeito das técnicas de separação de plasma e de seleção de esperma na recuperação e viabilidade do sêmen de garanhão pônei resfriado por 48h a 5°C]

Separation techniques of seminal plasma [centrifugation (SC) and Sperm Filter® (SF)] and sperm selection [Androcoll-E (SCA) and filtration glass wool (GW)] were used in 24 ejaculates from 6 stallions. In experiment 1, the ejaculates were allocated into control (no spin), centrifugation at 600 g x 10min, SF and GW. In experiment 2, semen was submitted to SC, SGA and filtered through GW. Following the treatments in both experiments, samples were kept chilled at 5°C to 50 x 106 sperm/ml for 48h. The variables measured on fresh and cooling semen were pH, motility, membrane viability function by 6-carboxyfluorescein diacetate and propidium iodide (CFDA / PI), viability or vitality (eosin / nigrosine) and mitochondrial activity. In experiment 1, centrifugation to remove seminal plasma resulted in greater damage to sperm than separation by sperm filter, and selection by glass wool was more efficient in separating viable cells and maintaining viability during cooling. In experiment 2 Androcoll-E and glass wool treatments resulted in higher (P <0.0001) motility, membrane function, mitochondrial activity, and viability than centrifuged semen. Both selection by Androcoll- E and glass wool improved the quality of semen pony stallions for preservation for up to 48h to 5ºC.(AU)

As técnicas de separação do plasma seminal (centrifugação, SpermFilter) e de seleção espermática (Androcoll-E e filtração por lã de vidro) foram aplicadas em 24 ejaculados de seis garanhões da raça Pônei Brasileiro. Após coleta e separação da fração gel, os ejaculados foram diluídos 1:1 com diluente à base de leite em pó. No experimento 1, os ejaculados foram distribuídos em controle (sem centrifugação), centrifugação a 600g x 10min, SpermFilter e filtração por lã de vidro. No experimento 2, o sêmen foi submetido aos procedimentos: centrifugado (SC), centrifugado com Androcoll-E e filtrado por lã de vidro. Após os procedimentos de ambos os experimentos, as amostras foram mantidas refrigeradas a 5ºC, com 50 x 106 espermatozoides/mL, por 48h. As variáveis mensuradas a fresco, 24h e 48h foram: pH, motilidade, funcionalidade de membrana, viabilidade por diacetato de carboxifluoresceína e iodeto de propídio (CFDA/PI, vitalidade (eosina/nigrosina) e atividade mitocondrial. Já osmolaridade e morfologia espermática foram avaliadas somente imediatamente após a coleta. No experimento 1, a centrifugação para retirada do plasma seminal resultou em maiores danos aos espermatozoides do que a separação por SpermFilter. A filtração por lã de vidro mostrou-se mais eficiente em separar células viáveis e manter a viabilidade durante o resfriamento. No experimento 2, os tratamentos com Androcoll-E e filtrado por lã de vidro foram superiores (P<0,0001) ao sêmen centrifugado quanto à motilidade, à funcionalidade de membrana, à atividade mitocondrial e à viabilidade, tanto nas amostras de sêmen fresco como de sêmen refrigerado. O Androcoll-E e a lã de vidro permitiram manter por 48h, a 5ºC, o sêmen de garanhões pôneis utilizando-se diluente à base de leite.(AU)

Influence of climatic conditions on in vitro production of bovine embryos / Influência do clima na produção in vitro de embriões bovinos

Temperature and rainfall were analyzed daily during six years to evaluate their influence on in vitro production of bovine embryos. Weekly replications (n=480) were performed on 14,778 ovaries collected at slaughterhouses. Cumulus oocyte complexes (n=19,180) were fertilized with a pool of Bos taurus taurus semen in one incubator with 5 percent CO2. Presumable zygotes were cultured in gasified plastic bags with 5 percent CO2, 5 percent O2, and 90 percent N2. In the first year, cleavage and embryo yield were 60.3 percent and 15.6 percent, respectively, being lower (P<0.05) than in the following years. Average cleavage rates were always lower in winter (P<0.0001), thus producing less embryos. Winter climatic conditions had a negative influence on in vitro production, when cleavage and embryo yield declined, possibly because of reduced availability and growth of native pasture.

A temperatura e a precipitação pluviométrica foram analisadas diariamente, durante seis anos, para avaliar sua influência sobre a produção in vitro de embriões bovinos. As repetições semanais (n=480) foram realizadas com 14.778 ovários coletados em matadouros. Os oócitos (n=19.180) foram maturados em estufa com atmosfera com controle de temperatura e umidade saturada com 5 por cento de CO2 e, após 20h, foram fecundados com sêmen de Bos taurus taurus e mantidos sob as mesmas condições de atmosfera da maturação. Os zigotos foram cultivados em placas de quatro poços em bolsas gaseificadas com 5 por cento de CO2, 5 por cento de O2 e 90 por cento de N2, à temperatura de 39ºC e umidade saturada. No primeiro ano, a taxa clivagem (60,3 por cento) e a produção de embriões (15,6 por cento) foram inferiores (P<0,05) aos demais anos. As taxas de clivagem foram sempre menores no inverno (P<0,0001). As condições climáticas no inverno tiveram influência negativa sobre a produção in vitro de embriões bovinos e houve diminuição nos índices de clivagem e produção de blastocistos, possivelmente devido à reduzida disponibilidade e crescimento da pastagem nativa.

Avaliaçäo de diferentes concentraçöes de glicerol e sacarose no congelamento ultra-rápido de mórulas Mus musculus / Ultrarapid freezing of Mus musculus morulae with different concentrations of glycerol and sucrose

Mórulas Mus musculus da cepa nCF1 Suiço Albina, colhidas 76 a 78h após a administraçäo de hCG, foram congeladas em PBS modificado, contendo glicerol 3,0 ou 4,0 M, associado a sacarose 0,25 ou 0,5 M. Cento e sessenta e quatro mórulas excelentes (Grau I) ou boas (Grau II) foram colocadas em 0,05 ml da soluçäo de congelamento, em grupos de 5 a 11, para um período de desidrataçäo de 5 minutos, à temperatura ambiente (20 - 23§C), durante o qual foi processado o envase em palhetas de 0,25 ml. As palhetas contendo os embriöes foram mantidas em vapor de nitrogênio (N2) durante 2 minutos, antes da imersäo em N2 líquido. Após o descongelamento em banho-maria, a 37§C, por 20 segundos, a diluiçäo do crioprotetor foi efetuada em 0,5 ml de uma soluçäo de sacarose 0,5 M, durante 5 minutos, à temperatura ambiente. Os embriöes viáveis foram cultivados a 37§C, em PBS modificado + 20 SFB e avaliados 24 e 48 h após o início do cultivo. Os índices de sobrevivência foram semelhantes (P>0,05) com a utilizaçäo de glicerol 3,0 a 4,0 M, nos três momentos de avaliaçäo. Na avaliaçäo efetuada logo após a diluiçäo dos crioprotetor, näo foram observadas diferenças entre as concentraçöes 0,25 e 0,5 M (P>0,05), embora os índices de sobrevivência o//btidos com sacarose 0,25 M tenham sido superiores aos verificados com sacarose 0,5 M, após (P<0,05) e 48 h de cultivo (P<0,01). Uma diminuiçäo da viabilidade foi verificada a partir do tempo zero de avaliaçäo, até 24 h de cultivo, embora os índices de sobrevivência tenham se mantido constantes, entre 24 e 48h de cultivo

Avaliaçäo de diferentes concentraçöes de sacarose e lactose associadas a glicerol 2.0 M no congelamento ultra-rápido de mórulas Mus musculus / Ultra-rapid freezing of Mus musculus morulae with different concentrations of sucrose and lactose associated to 2.0 M glycerol

Seiscentos e vinte e oito (628) mórulas Mus musculus da cepa CF1 Suiço Albina, colhidas 76 a 78 h após a administraçäo de HCG, foram congeladas em soluçäo de PBS modificado contendo glicerol 2,0 M associado a três níveis crescentes de sacarose e lactose (0,125, 0,25 e 0,5 M). Mórulas excelentes (Grau I) e boas (Grau II) foram colocadas em 0,05 ml da soluçäo de congelamento, em grupos de 4 a 11, para um período de desidrataçäo de 5 minutos, a temperatura ambiente (20-23§C), durante o qual foi processado o envase em palhetas de 0,25 ml. Depois de seladas, as palhetas foram mantidas em vapor de nitrogênio (N2) durante 2 minutos, e logo após imersas em N2 líquido. O descongelamento foi efetuado em banho-maria a 37§C, por 20 segundos, sendo a remoçäo do crioprotetor efetuada em 0,5 ml de uma soluçäo contendo o mesmo açucar utilizado no congelamento, nas concentraçöes 0,25 e 0,5 M, durante 5 minutos, a temperatura ambiente. Os embriöes viáveis foram cultivados em PBS modificado + 20//SFB, a 37§C, sendo avaliados 24 e 48 h após o início do cultivo. Foi observada uma reduçäo dos índices de sobrevivência com a utilizaçäo de sacarose e lactose 0,5 M, sendo mais acentuada entre 24 e 48 h de cultivo. No entanto, os índices de sobrevivência se mantiveram praticamente constantes, neste mesmo intervalo, com as concentraçöes 0,125 e 0,25 M de sacarose e lactose. O índice médio de sobrevivência obtido com lactose foi superior ao obtido com sacarose, após 48 h de cultivo (P<0,05). As concentraçöes 0,25 e 0,5 M de sacarose e de lactose foram igualmente efetivas (P>0,05) no processo de remoçäo do crioprotetor. Após a transferência in vivo de mórulas congeladas em glicerol 2,0 M + sacarose 0,25 M, foi obtido um percentual de 50//de implantaçöes e 10//de fetos. Devido ao baixo índice de desenvolvimento fetal observado, a mistura de glicerol 2,0 M + sacarose 0,25 M foi considerada inadequada para o congelamento ultra-rápido de mórulas de camundongos, nas condiçöes deste experimento